大腸埃希桿菌性胃腸炎檢查
1.采集標(biāo)本
以無菌棉拭子蘸取腹瀉病患者糞便，如無糞便，以浸濕磷酸鹽緩沖液的直腸拭子插入肛門4～6cm(嬰幼兒2～3cm)處，在直腸內(nèi)旋轉(zhuǎn)擦取直腸表面黏液后取出，盛于運(yùn)送或保存液中，如不能及時(shí)送檢，樣品應(yīng)在4℃冷藏保存，但以不超過8h為宜。
2.增菌和分離培養(yǎng)
對于大腸埃希桿菌的分離應(yīng)在初代分離時(shí)選用弱選擇性培養(yǎng)基，如伊紅亞甲藍(lán)、中國藍(lán)薔薇酸式山梨醇麥康凱平板。劃線分離，35～37℃培養(yǎng)18～24h后，觀察菌落形態(tài)特征，選取紫紅色或暗紅色、大小1～3mm、邊緣整齊有光澤、中央凸起的單個(gè)菌落進(jìn)行鑒定，鑒定程序見圖1。
3.鑒定
(1)初步鑒定：
根據(jù)菌落特征、涂片染色的菌形及染色反應(yīng)，取純培養(yǎng)物細(xì)菌作生化反應(yīng)，凡符合于表1所示結(jié)果可初步鑒定為大腸埃希桿菌。
(2)最后鑒定：
一般常規(guī)檢驗(yàn)做到上述初步鑒定即可，必要時(shí)可按《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》所列生化反應(yīng)做出最后鑒定，其中主要的鑒定試驗(yàn)為：觸酶陽性，氧化酶陰性;發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣或遲緩發(fā)酵產(chǎn)酸，不發(fā)酵肌醇;IMVC反應(yīng)分別為 ， ，-，-(占94.6%);脲酶陰性，H2S陰性，苯丙氨酸脫氨酶陰性，硝酸鹽還原陽性，動(dòng)力多數(shù)陽性。簡便的方法是采用腸桿菌科試劑盒，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果編碼后做出最后鑒定。
(3)鑒定試驗(yàn)：
某些大腸埃希桿菌，尤其是無動(dòng)力的不發(fā)酵乳精株，應(yīng)與志賀菌相鑒別，二者的主要鑒別試驗(yàn)可用醋酸鈉和葡萄糖銨利用試驗(yàn)及黏質(zhì)酸鹽產(chǎn)酸3種試驗(yàn)。大腸埃希桿菌均為陽性，而志賀菌為陰性。
?、僦虏⌒源竽c埃希桿菌：
A.假定試驗(yàn)：于鑒別平板上菌落生長稠密處挑取培養(yǎng)物，以EPEC的3種多價(jià)O血清作玻片凝集試驗(yàn)。如與某一種多價(jià)O血清凝集，再與該多價(jià)血清所包含的O單價(jià)血清做試驗(yàn)。如與某個(gè)O單價(jià)血清凝集，再挑取3～5個(gè)單個(gè)菌落，與該血清作凝集試驗(yàn)。
B.生化試驗(yàn)：選擇O單價(jià)血清強(qiáng)凝集的菌落接種三糖鐵瓊脂，懸掛靛基質(zhì)試紙片，經(jīng)36℃培養(yǎng)18～20h。凡是乳糖、蔗糖產(chǎn)酸，葡萄糖產(chǎn)酸并多數(shù)產(chǎn)氣，H2S陰性，靛基質(zhì)陽性的菌株，可證實(shí)為大腸埃希桿菌。如果靛基質(zhì)為陰性時(shí)，還必須V-P試驗(yàn)為陰性，且不能在西蒙枸櫞酸鹽瓊脂上生長，方可證實(shí)為大腸埃希桿菌。
C.血清學(xué)證實(shí)試驗(yàn)：刮取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，用生理鹽水制成菌懸液，稀釋至與MacFarland 3號比濁管相當(dāng)?shù)臐舛取?單價(jià)血清如果原效價(jià)在1∶(160～320)，則可l∶40稀釋(用0.5%鹽水)。在10mm*75mm試管內(nèi)，將稀釋的抗血清與菌懸液等量混合，于50.6℃水溫中16h后觀察結(jié)果。如果出現(xiàn)凝集，可證實(shí)為該O因子。
?、诔鲅源竽c埃希桿菌：
已知為出血性腸炎患者的糞便，可劃線接種以山梨醇代替乳糖的麥康凱瓊脂平板。經(jīng)培養(yǎng)后，挑選3～5個(gè)山梨醇不發(fā)酵的菌落，以O(shè)157血清(最好同時(shí)再以H7血清)作玻片凝集試驗(yàn)和單管凝集試驗(yàn)以確定診斷。
分離的菌株應(yīng)接種三糖鐵瓊脂，懸掛靛基質(zhì)試紙片，經(jīng)36℃培養(yǎng)18～20h。典型的生化特性為乳糖、蔗糖產(chǎn)酸，葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，H2S陰性，靛基質(zhì)陽性。并接種山梨醇發(fā)酵管，為遲緩發(fā)酵。
?、鄱拘源竽c埃希桿菌：
A.生化試驗(yàn)：于鑒別平板上挑取可凝菌落5個(gè)，一般挑取乳糖發(fā)酵的典型菌落，分別接種三糖鐵瓊脂，懸掛靛基質(zhì)試紙片，經(jīng)36℃培養(yǎng)18～20h。凡是乳糖、蔗糖產(chǎn)酸，葡萄糖產(chǎn)酸并多產(chǎn)氣，H2S陰性，靛基質(zhì)陽性的菌株，可證實(shí)為大腸埃希桿菌。如果靛基質(zhì)為陰性時(shí)，還必須V-P試驗(yàn)陰性，且不能在西蒙枸櫞酸鹽瓊脂上生長，方可證實(shí)為大腸埃希桿菌。
B.腸毒素試驗(yàn)：產(chǎn)毒性大腸埃希桿菌主要靠腸毒素試驗(yàn)證實(shí)。腸毒素試驗(yàn)的方法甚多，國內(nèi)目前以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測定LT，以乳鼠灌胃試驗(yàn)測定ST，有時(shí)亦采用家兔結(jié)扎回腸段試驗(yàn)以測定LT和ST。
當(dāng)前已有采用基因診斷法測定這兩種腸毒素。
a.雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：將被檢菌株按5點(diǎn)環(huán)形接種于Elek培養(yǎng)基上，以同樣操作，共做兩份，于36℃培養(yǎng)48h。在每株菌的菌苔上放一片多黏菌素B紙片，于36℃經(jīng)5～6h，使腸毒素滲入瓊脂中。在離菌苔各5mm處的中央，挖一個(gè)直徑4mm的圓孔，并用一滴瓊脂墊底。在孔內(nèi)滴加LT抗毒素30μl，并用已知產(chǎn)LT和不產(chǎn)毒菌株作對照。于36℃培養(yǎng)15～20h觀察結(jié)果。在菌斑和抗毒素孔之間出現(xiàn)白色沉淀帶者為陽性，否則為陰性。
b.乳鼠灌胃試驗(yàn)：將被檢菌株接種于Honda產(chǎn)毒肉湯內(nèi)，于36℃培養(yǎng)24h，3000r/min離心30min，取上清液經(jīng)薄膜濾器過濾，60℃加熱30min，每毫升濾液內(nèi)加入2%伊文思藍(lán)溶液0.02ml。將此濾液用塑料小管注入1～4天齡的乳鼠胃內(nèi)0.1ml，同時(shí)接種3～4只。禁食3～4h后用氯仿麻醉，取出全部腸管，稱量腸管(包括積液)重量及剩余的體重。腸管重量與剩余體重之比大于0.09為陽性，0.07～0.09為可疑。
c.家兔結(jié)扎回腸段試驗(yàn)：將被檢菌株接種于Honda產(chǎn)毒肉湯，于36℃培養(yǎng)24h，3000r/min離心30min，取上清液經(jīng)薄膜濾器過濾。濾液分成兩份，一份不加熱，供測LT用;另一份60℃加熱30min，供測ST用。取體重2kg家兔，禁食1天。麻醉后剖腹，取出回腸段，按10～15cm為一段，分段結(jié)扎。取一段注射肉湯2ml作為陰性對照，另一段注射已知產(chǎn)毒菌肉湯培養(yǎng)物的濾液2ml作為陽性對照。其他各段分別注射待試菌株肉湯培養(yǎng)物的濾液2ml，將腹壁縫合。測定ST時(shí)，于注射后6～8h剖腹檢查;測定LT時(shí)，于注射后18h剖腹檢查。抽取各腸段內(nèi)的濾液，測定其容量，并測定腸段的長度。積液量(ml)與腸段長度(cm)之比大于1為陽性。
d.血清學(xué)試驗(yàn)：腸毒素試驗(yàn)陽性菌株可用ETEC有關(guān)的多價(jià)O血清及單價(jià)血清作玻片凝集試驗(yàn)，以確定其O抗原。
?、芮忠u性大腸埃希桿菌：
A.生化試驗(yàn)：于鑒別平板上挑取菌落3～5個(gè)，一般應(yīng)多挑取與志賀菌相似的不發(fā)酵乳糖的菌落，但發(fā)酵乳糖的優(yōu)勢菌落亦可適當(dāng)挑取。將挑取的菌落接種半固體管，36℃培養(yǎng)18～24h。有動(dòng)力的菌株一般可以棄去，除非經(jīng)血清學(xué)鑒定為0124。留下無動(dòng)力的菌株，接種三糖鐵瓊脂，懸掛靛基質(zhì)試紙片，36℃培養(yǎng)18～20h。同時(shí)并作賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)。EIEC的典型生化特性為：乳糖、蔗糖不產(chǎn)酸或產(chǎn)酸，葡萄糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，H2S陰性，靛基質(zhì)陽性，賴氨酸脫羧酶陰性，除O124外均無動(dòng)力。賴氨酸脫羧酸試驗(yàn)亦可以放在血清學(xué)試驗(yàn)以后做。
B.血清學(xué)試驗(yàn)：挑取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)物，用EIEC的兩個(gè)多價(jià)O血清作玻片凝集試驗(yàn)，以確定其O抗原的成分。
C.豚鼠角膜試驗(yàn)：將菌液滴入豚鼠眼內(nèi)2～5天內(nèi)觀察是否有紅腫、流淚、充血癥狀。
D.ELISA試驗(yàn)：用已知EIEC或志賀菌屬的有毒菌株免疫家兔，所得之免疫血清用同型的無毒菌株吸收。用ELISA法測定，EIEC各型的有毒菌株及志賀菌屬各型的有毒菌株均為陽性。此法系檢測被檢菌的侵襲性多肽，亦可采用基因探針法檢測。
?、菁坌源竽c埃希桿菌：
集聚性大腸埃希桿菌(EAEC)的重要特征是在Hap-2細(xì)胞周圍形成特征性的集聚性黏附。Yamamoto發(fā)現(xiàn)在37℃培養(yǎng)時(shí)，EAEC的此種聚集性黏附可發(fā)生在某些液體培養(yǎng)基的生長表面，形成很厚的黏附聚集性菌塊。在25℃或42℃則無此現(xiàn)象，液體培養(yǎng)基以L或M-H培養(yǎng)基最佳，以此可作為EAEC的初步鑒定手段。液體培養(yǎng)基中菌塊形成試驗(yàn)：大腸埃希桿菌接種于M-H液體培養(yǎng)基(Difco)，35～37℃溫育18～24h，凡表面(部分下沉管底)形成菌塊者為陽性，均勻混濁無菌塊者為陰性。1996年王梅等對腸道凝聚性-黏附性大腸埃希桿菌進(jìn)行簡易篩查試驗(yàn)，將M-H培養(yǎng)基上的菌塊形成試驗(yàn)與Hep-2細(xì)胞黏附試驗(yàn)進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)兩者的一致率達(dá)77%，如包括彌散型和局限型在內(nèi)則達(dá)88.5%。表明菌塊形成試驗(yàn)是可靠的初步篩查EAggEC的方法。
目前尚無相關(guān)資料。
