一、病因
PNH是一種獲得性疾病，從來沒有先天發(fā)病的報道(先天性CD59缺乏除外)，也沒有家族聚集傾向。致使造血干細胞發(fā)生病變的確切原因尚不清楚。本病是一種獲得性多能造血干細胞疾病，致病因素可能有化學(xué)、放射線或病毒感染等，致病染色體突變，發(fā)生異常干細胞株，其增殖、分化生成的紅細胞、粒細胞和血小板都有共同缺陷。
PNH是造血干細胞基因突變引起的克羅恩病，病態(tài)細胞與正常細胞同時存在，病態(tài)血細胞都來自同一克隆，證據(jù)是：①在G6PD同工酶呈雜合子的女性PNH患者中，不正常的紅細胞都具有同一種同工酶，說明異常細胞都出自同一來源;②近年來用分子生物學(xué)方法分析女性患者X染色體滅活類型，也可發(fā)現(xiàn)異常細胞都屬同一類型;③用流式細胞儀技術(shù)可以看到PNH患者的外周血和骨髓中總是異常與正常細胞同時存在，而異常細胞都具有同樣的不正常(如細胞表面缺乏CD59)，而患者的正常血細胞則無此種異常，說明有兩種細胞來源;④PNH患者的異常細胞可以查到磷脂酰肌醇糖苷-A(PIG-A)基因突變，而同一患者的正常細胞則無此突變，進一步說明兩者來源不同;⑤少數(shù)從PNH轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙园籽〉陌籽〖毎删哂蠵NH膜蛋白缺失的特征，說明白血病來自原有的PNH克隆。鑒于同一PNH患者的異常細胞缺失膜蛋白的程度可有不同，還有一些患者的PIG-A基因突變類型可不只1種，因此推測有的PNH可能有1個以上異?？寺?。PNH患者的紅細胞、中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、血小板等皆有膜蛋白缺失，可以想象基因突變必然發(fā)生在很早期的造血干細胞。但是為何PNH患者發(fā)生基因突變，有何外來的致突變原(mutagen)，尚不明了。此外，鑒于PNH患者常有1個以上的異?？寺。从幸环N以上的PIG-A基因突變;另外，2002年Horikawa K等還報道：1個與PNH發(fā)病無關(guān)的次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(Hypoxanthine-Guanine phosphoribosyl transferase，HPRT)基因，在PNH患者中也易發(fā)生突變，換言之，PNH患者有PIG-A突變同時有HPRT突變者明顯比沒有PIG-A突變的正常人為多。因而提示：除外界的致突變原外，是否患者還有內(nèi)在的基因不穩(wěn)定性(gene instability)。但Purow DB等1999年也曾對PNH患者的2個無關(guān)基因即HPRT及TcR基因進行觀察，結(jié)果表明：個別PNH患者同時具有上述2個基因之一的突變，而多數(shù)患者這2個基因沒有改變。因而PNH患者是否具有普遍的基因不穩(wěn)定性尚待進一步證實。
PNH患者的異?？寺〔痪哂凶灾鞯臒o限擴增的本質(zhì)，但畢竟要有一定的擴增能力，才能使異常細胞增多到足以產(chǎn)生疾病表現(xiàn)。鑒于PNH常與再生障礙性貧血(AA)相互轉(zhuǎn)化或同時存在，因而想到兩者是否在病因上也有關(guān)聯(lián)，即PNH克隆只有在正常造血細胞受抑制時才得以擴張。這樣，就要在致突變原之外，還要想到能引起AA的諸多病因，如由于某種因素如病毒、藥物等所致的能抑制造血細胞的自身免疫性疾病等。這就是PNH的雙重病因或兩步發(fā)病的觀點。
二、發(fā)病機制
PNH的發(fā)病機制涉及不只一個因素。
1.基因突變引起異常細胞克隆的出現(xiàn)
PNH異常血細胞的共同特點是細胞膜表面缺乏一組膜蛋白，這種膜蛋白都通過糖肌醇磷脂(GPI)連接在膜上，統(tǒng)稱糖肌醇磷脂連接蛋白(GPI連接蛋白)。所涉蛋白和GPI都在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成，一蛋白生成后旋即與GPI連接，然后轉(zhuǎn)移細胞膜外層。由于PNH細胞可以查到游離的這種蛋白和相應(yīng)的mRNA，因此，可以推想PNH異常細胞缺少GPI連接蛋白不是由于不能生成蛋白而是因為不能生成GPI，所以這種蛋白就不能存在于膜上。GPI由脂質(zhì)部分和核心結(jié)構(gòu)組成，不同種類GPI的脂質(zhì)部分差異很大，但核心結(jié)構(gòu)卻非常保守，均由1個肌醇磷脂、1個葡糖胺、3個甘露糖和1個乙醇胺按順序相連構(gòu)成，一頭經(jīng)肌醇磷脂上的2個脂肪酸(有的是3個)插入細胞膜脂質(zhì)雙層的外層，另一頭由乙醇胺與蛋白相接。GPI生成的每一步都需1個關(guān)鍵酶。
近年，用病毒感染PNH的異常淋巴細胞(如用EB病毒感染B淋巴細胞)建立細胞株。與小鼠的已知缺乏GPI并且已明確GPI生成障礙發(fā)生在那一步的不同胸腺瘤細胞株[Thy-1(-)細胞株]進行融合。若融合后可以表達GPI連接蛋白，說明兩者的缺陷不同，可以互補;若融合后仍不能表達GPI連接蛋白，說明兩者的缺陷相同，所以不能互補。用這種細胞融合的方法已經(jīng)在40例患者中得以證明PNH異常細胞的缺陷全都與A型Thy-1(-)細胞相同。缺乏GPI是由于生成GPI的第一步有障礙，即N-乙酰葡糖胺不能加到磷酸肌醇(PI)上去，因而不能進而再加入3個甘露糖和1個乙醇胺最后形成完整的GPI去連接蛋白。用放射性核素標(biāo)記GPI的不同組分，觀察GPI的生成過程，同樣可以發(fā)現(xiàn)PNH異常細胞不能生成GPI是由于上述障礙?，F(xiàn)知PNH異常細胞缺少1種蛋白，與小鼠的乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶有很大的同源性。目前，這種蛋白的cDNA和基因核苷酸序列已經(jīng)弄清，稱PIG-A基因。用熒光原位雜交技術(shù)證明位于X染色體p22.1部位。研究表明，在所有已檢測的PNH患者血細胞中都發(fā)現(xiàn)有PIG-A基因突變而導(dǎo)致GPI連接蛋白的部分或全部缺失，說明PIG-A基因突變在PNH發(fā)病中有重要作用。
PIG-A的cDNA有1452bp，編碼484個氨基酸。PIG-A基因核苷酸序列全長17kbp以上，有6個外顯子：第1個外顯子只有23bp，編碼5′端不翻譯區(qū);第2個外顯子有777bp，編碼5′端不翻譯區(qū)的其他部分和大約半個蛋白;第3個外顯子有133bp，編碼一部分蛋白;第4個外顯子133bp，編碼一部分蛋白;第5個外顯子207bp，編碼一部分蛋白;第6個外顯子長2316bp，編碼蛋白的其余部分和3′端不翻譯區(qū)。PIG-A基因的5′側(cè)翼583bp區(qū)內(nèi)有啟動子活性。此區(qū)無TATA樣序列，有4個CAAT框、2個AP-2序列、-1個CRE序列。PIG.A基因有2個可變剪接產(chǎn)物，分別少347和658個核苷酸。所以正常的PIG-A mRNA的RT-PCR產(chǎn)物也有3個條帶，分別為1500bp、1250bp、850bp，后兩者的編碼產(chǎn)物皆無功能。
PNH的PIG-A基因突變?yōu)楫愘|(zhì)性，迄今已報道100余種基因突變，廣泛分布于多個編碼區(qū)及剪接點，沒有突變叢集區(qū)或熱點。而且，主要以小突變?yōu)橹?，大的突變罕見。有典型溶血癥狀的PNH與AA-PNH綜合征相比，PIG-A突變的基因圖譜無明顯不同。據(jù)Rosse等(1995)綜合11個實驗室已報道的72例患者所見的84個突變中，53個為核苷酸缺失或插入，其中42個為缺失;大約1/3(84個突變中的24個)只有1個核苷酸缺失，僅有2個突變有大段(超過100個核苷酸)缺失;核苷酸插入相對較少，5例同時有缺失和插入。缺失或插入的主要后果是移碼，在51個小缺失或(和)插入突變中45個導(dǎo)致過早出現(xiàn)終止碼，使蛋白減小，1個越過終止碼使蛋白增加32個氨基酸。還有4個缺失突變改變了外顯子/內(nèi)含子剪接部位，影響PIG-A mRNA的大小和穩(wěn)定性。另有1個框內(nèi)缺失，由于缺少3個核苷酸使蛋白缺少了第151個氨基酸(苯丙氨酸)。所有突變中1/3(84個突變中的31個)屬點突變，1個核苷酸被另1個核苷酸替換。在這31個點突變中：18個為錯義突變，使蛋白的氨基酸序列中1個氨基酸被另1個氨基酸代替;6個為無義突變，產(chǎn)生1個立即終止碼;7個為剪接點突變，影響PIG-A mRNA大小和穩(wěn)定性。至今沒有發(fā)現(xiàn)過PIG-A基因5′啟動子區(qū)或3′非翻譯區(qū)的點突變。有1例大段缺失累及啟動子區(qū)、第1個外顯子和部分第1個內(nèi)含子。Kinoshita等(1995)從匯集的62例得到同樣認識，所有PNH患者均有PIG-A基因突變，突變部位隨機分布，62例中56個突變只涉及1、2個堿基變化，突變的后果以移碼最多見(占63%)。不同患者的PIG-A基因突變類型不同，在62例中只有5種突變同見于2、3個患者。若同一患者有2種異常細胞(GPI連接蛋白全無或缺少)，則可能源于2種突變產(chǎn)生的2種異?？寺。聦嵣弦恍┗颊唠m有2種異常細胞卻只能查到1種突變，也有的患者只有1種GPI連接蛋白完全缺失的異常細胞，卻能查出2種突變，這些病例都需仔細檢查。Luzzatto于2000年分析了全球28篇報道的146例PNH患者的全部174個PIG-A突變，其中135個(包括大段將是PIG-A基因產(chǎn)物的完全失去活性，另一組中35個是錯義突變、4個是小的框內(nèi)缺失，其結(jié)果是PIG-A基因產(chǎn)物部分功能缺失。前一組形成的細胞完全缺失GPI連接蛋白(相當(dāng)于PNH Ⅲ型細胞)，后一組形成的細胞部分缺失GPI連接蛋白(相當(dāng)于PNHⅡ型細胞)。Norris等初步研究了PIG-A基因突變位點的不同對PIG-A蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。作者分析了18例PIG-A基因的錯義突變，發(fā)現(xiàn)有6例位于編碼子128～129和15l～156上，這些編碼子位于小鼠和酵母PIG-A同源基因的高度保守的區(qū)域內(nèi)，因此，猜想這些編碼子可能編碼PIG-A蛋白的關(guān)鍵部分。作者用點誘變的方法，獲得具有這些編碼子突變的PIG-A的cDNA，分別轉(zhuǎn)入原核及真核表達系統(tǒng)，測其PIG-A蛋白的結(jié)構(gòu)及功能。結(jié)果表明，編碼組氨酸128(H128)、絲氨酸129(S129)和絲氨酸155(S155)的編碼子發(fā)生錯義突變可導(dǎo)致PIG-A蛋白功能的部分喪失，而發(fā)生于編碼側(cè)鏈氨基酸殘基的編碼子的錯義突變對PIG-A蛋白功能無影響。提示編碼H128、S129和S155的編碼子是影響PIG-A蛋白功能的關(guān)鍵部分。
總而言之，PNH患者的PIG-A突變部位遍布第2～6外顯子整個編碼區(qū)的多個位置，以及一些內(nèi)含子之中，沒有突變熱點。第2外顯子較長，突變發(fā)生部位也較多。突變類型多種多樣。不同患者的PIG-A突變常常不一樣，目前只發(fā)現(xiàn)極個別的同樣突變見于不同的患者。但是不知不同國家的患者是否可有差別，據(jù)報道，在日本20例突變中9個為堿基取代，只有1個為多堿基缺失;而在泰國的14例中只2個為堿基取代，卻有4個為多堿基缺失;歐美國家中大片段缺失較日本多見些。不知各地的致突變原是否會有不同。
將正常的PIG-A cDNA轉(zhuǎn)入PNH異常細胞可糾正后者不表達GPI連接蛋白的缺陷，PNH可由于PIG-A基因突變所致已能確定。然而，涉及GPI生成全過程的基因至少有12個，涉及上述第一步的基因除PIG-A外尚有PIG-C、PIG-H等。但除PIG-A外，其他基因都位于常染色體上，2個等位基因同時發(fā)生滅活突變的幾率極小。而PIG-A基因位于X染色體上，即使在女性只要產(chǎn)生突變的X染色體未被隨機滅活即可發(fā)病，所以至今除PIG-A基因突變外沒有發(fā)現(xiàn)過其它基因突變引起的PNH。
2.異常細胞克隆的維持和擴增
異常細胞克隆生成之后何以保持并能繼續(xù)擴增，特別是在正常造血細胞同時存在下。異常細胞如何競爭，在數(shù)量上增長到足以引起疾病表現(xiàn)的程度，目前尚不清楚，能想到的有以下2個方面：
(1)異常細胞不易凋亡，生命力較強：
1997年Brodsky RA等和Horikawa K等分別報道PNH患者的異常血細胞有抵御凋亡的能力，從而用以解釋異常細胞所占比例的增長。但是次年Ware RE等(1998)報道：有GPI連接蛋白的中性粒細胞與缺乏GPI連接蛋白的中性粒細胞凋亡率沒有區(qū)別;將PIG-A的cDNA導(dǎo)入PNH表型的B-淋巴細胞株，導(dǎo)入前與導(dǎo)入后細胞對Fas配基或X線誘導(dǎo)的凋亡沒有差別，說明PIG-A基因缺失與否不影響細胞凋亡。鑒于這種不同的觀察結(jié)果，PNH異常細胞是否不易凋亡尚待進一步研究，今后應(yīng)著重觀察較早期的造血細胞，比較PNH患者自己的異常和正常的以及正常人的同類細胞，在生理條件下或可能發(fā)生于體內(nèi)狀況下的細胞凋亡。
(2)異常細胞具有更強的增殖能力：
給經(jīng)過亞致死量照射的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺損癥小鼠輸注PNH患者或正常人的骨髓，7個月后，正常人骨髓消失，PNH患者骨髓仍存在。我院韓冰等2000年用流式細胞技術(shù)分選出PNH患者的CD34 CD59 細胞與患者本人的CD34 CD59- 細胞及正常人的CD34 CD59 細胞比較，結(jié)果不論是單個細胞培養(yǎng)還是群體細胞培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)基中均顯示：PNH患者的CD34 CD59- 細胞的分裂、集落形成和擴增總數(shù)等均比本身的CD34 CD59 細胞為多，而兩者又都比正常人的CD34 細胞為差。提示：PNH患者的早期造血細胞中表型異常者比表型正常者的增殖能力強，而兩者都不如正常人的相應(yīng)細胞，換言之，PNH的異常細胞對自身的正常細胞而言有一定的增殖優(yōu)勢，而患者的所謂正常細胞在增殖能力方面實際上不正常。但是，我院肖娟等同期用免疫磁株法分選細胞，在液體培養(yǎng)和半固體培養(yǎng)中都未能顯示PNH異常表型細胞的增殖優(yōu)勢，然而，患者的正常表型與異常表型的早期造血細胞的增殖能力都遠比正常人的同類細胞差，再次得到證實。另據(jù)報道，給PNH患者進行同基因骨髓移植，假如沒經(jīng)過適當(dāng)預(yù)處理，病情一度緩解后，仍將復(fù)發(fā)，似乎又說明PNH克隆具有增殖優(yōu)勢。然而，認為PIG-A基因失活的造血細胞不具備內(nèi)在的增殖優(yōu)勢的學(xué)者也可舉出一些例證：譬如，PIG-A基因失活的胚胎干細胞不能存活生長，若在早期胚胎發(fā)育期滅活PIG-A基因，成功地造成嵌合體，開始造血時只有5%的紅細胞和中性粒細胞缺乏GPI連接蛋白，其后百分?jǐn)?shù)逐漸減少，最后穩(wěn)定，說明這種細胞沒有繼續(xù)增殖的趨勢;又如，Araten DJ等(1999)發(fā)現(xiàn)多數(shù)正常人血中有缺少CD55及CD59的紅細胞和中性粒細胞，數(shù)量分別為22/100萬和8/100萬，并且也可查出PIG-A基因突變，但不發(fā)展為病?？傊?，PNH異?？寺∈欠窬哂袃?nèi)在的生長優(yōu)勢尚無定論，但是總體說來PNH患者的造血細胞增殖能力(不論是正常細胞還是異常細胞)都低于正常，可以確定。
(3)PNH異常克隆是在骨髓正常造血功能衰減的基礎(chǔ)上才取得相對的生長優(yōu)勢：
我院李強等(1997)、肖娟等(2000)、韓冰等(2000)分別在自己的工作中發(fā)現(xiàn)同一現(xiàn)象，即PNH患者骨髓中的CD34 造血干/祖細胞比正常人少，而且其中CD59- 細胞又比CD59 明顯為多，提示PNH患者的正常造血干/祖細胞數(shù)量少，異常造血干/祖細胞在數(shù)量上占有相對優(yōu)勢，可以推測PNH異?？寺∈窃谡Ｔ煅δ芩ソ叩幕A(chǔ)上才得以擴張的。2001年泰國Pakdeesuwan K等也有類似觀察發(fā)現(xiàn)。早在1961年Dacie和Lewis等即提出在臨床上PNH與再生障礙性貧血有密切關(guān)系，以后，許多學(xué)者證實并認為兩者在發(fā)病機制上也有關(guān)聯(lián)。近年的一種觀點是PIG-A基因突變在正常人和不少情況下都可發(fā)生，但只有當(dāng)正常造血功能衰竭時，才有可能發(fā)展為疾病。甚至認為必然有再障才會發(fā)生PNH，并且將注意力集中在自身免疫性再障上，提出正常造血細胞表面具有一些GPI連接蛋白，可以成為能刺激細胞殺傷性細胞(如T淋巴細胞)的抗原或協(xié)同刺激因子，從而被殺傷，而有PIG-A基因突變的細胞由于缺失GPI連接蛋白，因而可以逃避捕殺。Karadimitris A等(2000，2001)提出：分析T細胞的所有組成成分可能發(fā)現(xiàn)異常，自身反應(yīng)性T細胞的靶向中有GPI連接蛋白。我院王毓洲等2000～2001年的工作也發(fā)現(xiàn)：PNH患者外周血中T8細胞/T4細胞比例增高，帶有HLA-DR標(biāo)志的活化的CD8。淋巴細胞增多;γ干擾素和IL-2對CD34 CD59 的正常造血干/祖細胞有抑制作用。支持PNH有免疫失常，并對正常造血細胞不利的說法。認為有免疫因素參與可以解釋PNH發(fā)生于一些后天性再障之后，但很少發(fā)生在先天性再障或化療藥物引起的骨髓造血衰竭之后。然而，PNH與再障的關(guān)系可能沒有這樣簡單，因為PNH的病癥不發(fā)生在再障的骨髓抑制最嚴(yán)重的時期，而往往在再障恢復(fù)之后;另外，PNH常發(fā)生在再障患者應(yīng)用免疫抑制劑。ATG等取得緩解以后，而不是在自身反應(yīng)性T淋巴細胞未被抑制之時。再者，PNH患者病情的起伏和穩(wěn)定乃至自然緩解，都需要另求解釋。
(4)其他：
PNH患者的血清對正常造血干/祖細胞的影響，觀察結(jié)果不一。據(jù)王毓洲2001年觀察，患者的CD59 或淋巴細胞及其培養(yǎng)上清液對CD34 細胞的增殖均無影響;據(jù)韓冰2000年觀察：PNH患者的骨髓成纖維細胞的集落形成能力正常，成纖維細胞的TNFα、IL-6的mRNA表達也正常;另有人觀察，患者血清中EPO及G-CSF增高，IFNγ正常。另外Nishimura等提出：FGFβ受體也是GPI連接蛋白，PNH的造血細胞由于缺乏TGF受體，所以不受TGF的增殖抑制作用。
總之，關(guān)于PNH的發(fā)病機制近年雖有不少研究，PIG-A基因突變和骨髓正常造血細胞增殖功能衰減是兩個重要因素，但是如何形成異常造血細胞與正常造血細胞生成和增殖的不均衡狀態(tài)，異常細胞如何在數(shù)量上取得優(yōu)勢，影響異常細胞數(shù)量和PNH病情發(fā)展和變化的因素是什么，PNH如何得到自然緩解，造血微環(huán)境有無變化等，都還需要進一步研究。
